Hora de publicación: 2022-03-16 Origen: Sitio
El genoma de un organismo se almacena dentro de la molécula de ADN, pero analizar esta información genética requiere grandes cantidades de ADN. En 1985, Kary Mullis inventó un método eficiente para replicar masivamente pequeñas cantidades de ADN en un corto período de tiempo. Al calentar, las dos hebras de la molécula de ADN están separadas, y los bloques de construcción de ADN agregados se unen a cada hebra. Con la ayuda de la ADN polimerasa enzimática, se pueden formar nuevas hebras de ADN y el proceso se puede repetir. PCR es de gran importancia tanto en la investigación médica como en la ciencia forense.
El nombre completo de PCR es la reacción en cadena de la polimerasa. Es una tecnología muy poderosa que puede replicar el ADN de una manera muy simple pero eficiente. Puede considerarse como una replicación especial de ADN fuera del organismo. La característica más grande de PCR puede aumentar enormemente la cantidad de rastro de ADN.
La replicación de ADN es la base de una gran cantidad de investigaciones, por ejemplo, cuando secuemos ARN, el ARN debe convertirse primero en ADN y replicado en números grandes. Cuando se secuencien el genoma de una persona, no podemos secuenciar una celda o una sola molécula. La base de la secuenciación requiere tener un gran número de copias idénticas de las moléculas de ADN, por lo tanto, la replicación del ADN es una herramienta fundamental en la investigación biológica. Entonces, ¿cómo consigues tantas copias? La PCR es como una copiadora, aprovechando varias propiedades del ADN para convertirse en un excelente método para la replicación masiva del ADN.
1. Paso inicial: esto es necesario para la PCR de inicio en caliente, calentando la mezcla de reacción a 94-98 grados para activar la ADN polimerasa. El tiempo de este paso depende de la ADN polimerasa elegida.
2. Paso de desnaturalización: el ADN en sí mismo es una estructura de doble cadena, y la amplificación de ADN requiere la combinación de cebadores y plantillas de ADN de varátoras. En este paso, la mezcla de reacción se calienta a 94-98 grados durante 20-30 segundos para romper los enlaces de hidrógeno entre las cadenas dobles y suelte el ADN de un solo trenzado. Este es el primer paso en el ciclo de PCR.
3. Paso de recocido: después de la desnaturalización, existe la plantilla de ADN en la mezcla de reacción como una sola hebra. Debido a que los cebadores en el sistema de reacción son complementarios a la plantilla de ADN, cuando la temperatura de reacción cae a 50-65 grados, los cebadores forman enlaces de hidrógeno con las secuencias complementarias. La temperatura de recocido depende principalmente del valor TM del cebador, que suele ser de 3 a 5 grados más bajo que el valor TM del cebador. Este paso generalmente dura entre 20 y 40 segundos, y la polimerasa se unirá al dúplex de la plantilla de imprimación para iniciar la síntesis de ADN.
4. Paso de extensión: En este paso, la ADN polimerasa inicia la síntesis de ADN, por lo que la temperatura de este paso es la temperatura óptima de la ADN polimerasa. Por lo general, elegimos 72 grados, pero la temperatura óptima para algunas polimerasas de ADN es de 68 grados. Este paso es muy similar a la replicación del ADN in vivo: la ADN polimerasa agrega DNTPS al extremo 3 'de la imprimación de acuerdo con la ley de la complementación de la base, y finalmente se obtiene un nuevo fragmento de doble cadena de ADN. El tiempo de extensión depende de la longitud del fragmento de ADN de interés y la capacidad de síntesis de la ADN polimerasa. En general, las polimerasas de ADN pueden sintetizar 1 KB ADN cada 60 segundos.
5. Los pasos 2 a 4 se denominan ciclo: la cantidad de ADN después de cada ciclo es el doble que el anterior. Típicamente se realiza una reacción de PCR para 30-35 ciclos. Durante las primeras rondas de ciclo de PCR, la cantidad de producto de PCR aumentó exponencialmente, pero en la etapa posterior de la reacción, con la reducción de la cantidad de DNTPS y cebadores y la inactivación de la ADN polimerasa, la velocidad de reacción disminuyó gradualmente, por lo que El rendimiento de la reacción de PCR también disminuyó. restringido.
6. El paso final de la extensión: después de 30-35 ciclos, generalmente se extienden a 68-74 grados durante 5-10 minutos, lo que es hacer que todo el ADN de cadena simple restante en el sistema de reacción complete la reacción.
7. Tiempo de mantenimiento: generalmente establecemos 4-10 grados como la temperatura de almacenamiento de los productos de PCR después de la reacción.